Lendenwirbel tumor_6

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Kapitel 6: Primäre Kultur und präsumtiven Identifizierung von Meningokokken. Streptococcus pneumoniae. und Haemophilus influenzae

Mikrobiologie-Laboratorien erhalten häufig Liquor (CSF) oder Blutproben von Patienten mit Meningitis, Lungenentzündung oder einer unklaren fieberhaften Erkrankung. Laboratories können auch Gelenkflüssigkeit, Pleuraflüssigkeit oder anderen sterilen Proben von diesen Patienten erhalten. Präsumtiven Identifizierung von N. meningitidis. S. pneumoniae. und H. influenzae kann auf der Grundlage einer zytologischen Untersuchung des CSF spezifische Koloniemorphologie auf Blut und / oder Schokolade-Agar, Färbeeigenschaften auf einem Gram-Färbung oder durch Nachweis von spezifischen Antigenen in der CSF von einem Latex-Agglutinationstest oder unter Verwendung eines schnellen gemacht werden Diagnosetest (RDT). Verfahren zur Identifizierung von Zweit N. meningitidis, S. pneumoniae, und H. influenzae Identifizierung und Charakterisierung von: sind in den nächsten Kapiteln dieses Laborhandbuch (Kapitel 7 vorgestellt N. meningitidis . 8: Identifizierung und Charakterisierung von S. pneumoniae . und 9: Identifizierung und Charakterisierung von H. influenzae ).

Das Personal, das in Gefahr Routine Exposition gegen aerosolized sind N. meningitidis in Erwägung ziehen, sollte die Impfung. Biologische Sicherheit: Zusätzliche Sicherheit und Gesundheit Informationen finden Sie in Kapitel 4 zu finden. Während Labor erworbenen Infektionen mit S. pneumoniae oder H. influenzae sind nicht so ausführlich berichtet, mit diesen Bakterien tödliche Infektionen auftreten können, und die Impfung gegen diese Organismen können in einigen Laboratorien empfohlen werden.

Da der primäre Zweck dieser Anleitung ist bei der Identifizierung zu helfen von N. meningitidis, S. pneumoniae. und H. influenzae aus klinischen Proben von Verdachtsfällen von bakterieller Meningitis gesammelt, die hier beschriebenen Methoden zur Identifizierung von anderen Isolaten nicht erlauben, die von klinischer Bedeutung sein können, jedoch weniger wahrscheinlich auftreten. Microbiologists zu klinischen Mikrobiologie Handbüchern, wie die amerikanische Gesellschaft für Mikrobiologie beziehen sollte s Manual of Clinical Microbiology. für andere Verfahren Bakterien zu identifizieren.

Die Verarbeitung Liquorproben

Eine Anmerkung über Zentrifugation: g (1 x Schwerkraft) repräsentiert relative Zentrifugalkraft (RCF), aber die empfohlene Zentrifugierungsgeschwindigkeit oft in den Protokollen als Umdrehungen pro Minute (RPM) aufgeführt. RCF ist abhängig von der Länge des Radius des Rotors, also die gleiche Drehzahl können die gleiche g-Kraft in ein anderes Zentrifugen nicht erzeugen. Daher sollte RCF verwendet werden, um die Zentrifugendrehzahl zu beschreiben. Wenn nur RPM angegeben wird, kann RCF berechnet werden unter Verwendung dieser Formel:

RCF = 0.00001118 x r x RPM 2
r = Radius des Rotors in Zentimetern

Sobald der CSF im mikrobiologischen Labor ankommt, sollte das Volumen von CSF für die Analyse verfügbar zu beachten. Ob lt; 1 ml CSF vorhanden ist, sollte es nicht zentrifugiert werden; stattdessen sollte die CSF direkt auf eine Blut-Agar-Platte (BAP) und auf eine Schokolade-Agar-Platte (CAP) und auch für die Gram-Färbung verwendet plattiert werden. Ob gt; 1 ml CSF verfügbar ist (d.h. wenn das Probenvolumen für die Zentrifugation ausreichend ist), ist es bei einer Kraft, die ausreicht, um sedimentieren die Bakterien zentrifugiert werden müssen. Typischerweise ist der Zentrifugation bei 1000 x g für 10 bis 15 Minuten ausreichend, um Sedimentbakterien.

Nachdem die Probe zentrifugiert wurde, sollte der Überstand mit einer Pasteurpipette abgezogen werden und reserviert, wenn Antigennachweis durch Latexagglutination ist geplant. Das Sediment sollte kräftig gemischt werden (zum Beispiel in einem geschlossenen Rohr ein Wirbelmaschine). Sobald es gut gemischt wurde, ein oder zwei Tropfen des Sediments sollte zur Vorbereitung verwendet werden sollte, die Gram-Färbung und ein Tropfen der primären Kulturmedien Streifen verwendet werden.

Die zytologische Untersuchung des GFK

Laboruntersuchung des CSF ist in der Regel der erste Schritt, um die Anwesenheit von bakterieller Meningitis zu bestätigen. Beachten Sie, dass die zytologische Untersuchung sollte Zentrifugation und Erwärmung des CSF vorangehen. Typische CSF Anomalien mit bakterieller Meningitis gehören die folgenden:

  • Trübheit
  • Erhöhte Öffnungsdruck (gt; 180 mm Wasser)
  • Pleocytosis (in der Regel von polymorphkernigen (PMN) Leukozyten); WBC-Zahlen gt; 10 Zellen / mm 3
  • Verminderte Glukosekonzentration (lt; 45 mg / dl)
  • Erhöhte Proteinkonzentration (gt; 45 mg / dl)

Hinweis: normale Zytologie des CSF eines Säuglings ist 10-30 WBC / mm 3 (50% PMN).

Präsumtiven Identifizierung von Gram-Färbung, Latexagglutinations oder diagnostischen Schnelltest (RDT)

In Kombination mit einem Krankheitsbild und Liquoruntersuchung im Einklang mit bakterieller Meningitis, eine Verdachtsdiagnose einer bakteriellen Meningitis verursacht durch N. meningitidis. S. pneumoniae. oder H. influenzae kann eine Gram-Färbung des Liquor oder durch den Nachweis von spezifischen Antigenen im Liquor durch einen Latexagglutinationstest oder mit RDTs nach der Durchführung gemacht werden. Positive Ergebnisse für jede dieser Tests können Anzeichen einer Infektion schnell zur Verfügung stellen, auch wenn Kulturen wachsen scheitern.

Durchführen einer Gram-Färbung

Die Gram-Färbung ist ein empirisches Verfahren zur Bakterienarten in zwei große Gruppen Differenzierung auf der Grundlage der chemischen und physikalischen Eigenschaften ihrer Zellwände. Gram-positive Bakterien behalten die primären Fleck, während Gram-negative Bakterien, die Farbe des counterstain nehmen. Eine Gram-Färbung kann auch dazu dienen, die Qualität einer klinischen Probe zu bewerten. Die CSF sollte richtig zentrifugiert, um das Sediment werden für das Verfahren zu erhalten. Proper-Abstrich Vorbereitung des Liquor unter Verwendung sollte eine Monoschicht von Organismen dicht genug für eine einfache Visualisierung erzeugen, aber dünn genug morphologischen Eigenschaften zu offenbaren. Sauber, neue Glasträger verwendet werden. Positive und negative Qualitätskontrolle (QC) Stämme mit den unbekannten Proben getestet entlang werden sollte. Zusätzlich zu bekannten Referenzstämme für N. meningitidis. S. pneumoniae. und H. influenzae. andere Referenzstämme, die verwendet werden können, umfassen Staphylococcus aureus für gram-positive Kokken und Escherichia coli für gram-negative Stäbchen.

Gram-Färbung Verfahren für CSF
  1. Zentrifugieren Sie die CSF für 10-15 Minuten bei 1000 x g, wenn gt; 1 ml zur Verfügung steht (siehe oben).
  2. Unterteilen eines Glasträger in zwei Abschnitte mit einem Marker. Verwenden Sie einen Abschnitt für den unbekannten CSF und dem anderen Abschnitt für einen bekannten Organismus für QC.
  3. Bereiten Sie einen Abstrich von 1-2 Tropfen des gut gemischten Liquor auf der Folie platzieren, so dass der Tropfen (s) eine große leicht trübes, gleichmäßige Suspension zu bilden.
    • mit einem Isolat, fügen Sie einen kleinen Tropfen steriles Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung auf die Folie und schaffen eine leicht trübe, gleichmäßige Suspension von Zellen aus einer Übernachtkultur auf einen Abstrich vorzubereiten.
    • Lassen Sie die Suspension Luft trocknen lassen. Die Suspension muss vollständig trocken sein, bevor Sie fortfahren.
    • Befestigen Sie den Abstrich durch die die Folie mit 95% Methanol für mindestens 2 Minuten überschwemmt (3). Spülen Sie mit destilliertem Wasser. Schütteln Sie überschüssiges Wasser.
      • Wenn Methanol nicht verfügbar ist, wärme fixieren die Abstriche von schnell die Folie durch eine Flamme dreimal vorbei. Sie nicht die Folie als ein Überhitzen Über Wärme wird erhebliche Verzerrung oder Zerstörung der Zellen führen.
      • Es ist möglich, einfach Wasser (Filet d zu verwenden, eau de Robinet), wenn kein destilliertes Wasser für den gesamten Gramfärbung Verfahren.
      • Flood die Folie mit Kristallviolett Ammoniumoxalat für 1 Minute bis Fleck. Spülen Sie mit destilliertem Wasser. Schütteln Sie überschüssiges Wasser.
        • Vermeiden Sie die Folie mit der Spitze der Reagenzflasche zu berühren oder Flüssigkeit Anwendung direkt auf den Abstrich.
        • Flood die Folie mit Gram s Jod für 1 Minute. Das Iod wirkt als Beizmittel, wie es die Alkalikristallviolett-Farbstoff an die Zellwand bindet. Spülen Sie mit destilliertem Wasser. Schütteln Sie überschüssiges Wasser.
        • Entfärben mit 95% Ethanol, bis keine Flecken abwäscht (5-10 Sekunden kann genug sein). Spülen Sie mit destilliertem Wasser. Schütteln Sie überschüssiges Wasser.
          • Es ist wesentlich, Entfärbung eng anzuzeigen: gram-positive Bakterien können durch Über Entfärbung und gram-negative Bakterien zu erscheinen gram-negativ gemacht werden kann, hergestellt werden erscheinen gram-positive durch unter Entfärbung.
          • Gegenfärbung mit Safranin für 30 Sekunden oder mit Karbolfuchsin für 10-15 Sekunden. Spülen Sie mit destilliertem Wasser. Schütteln Sie überschüssiges Wasser.
          • tupfen vorsichtig die Folie saugfähiges Papier oder mit einem sauberen Papiertuch. Lassen Sie Luft trocknen lassen.
          • Wenn es trocken ist, untersuchen Sie die gefärbten Abstrich unter dem Mikroskop mit 100-facher -Ölimmersionsobjektiv.
          Beim Lesen der Gram-Färbung Ergebnisse (bei der mikroskopischen Untersuchung):
          • Gram-positive Organismen dunkelviolett oder violett erscheinen.
          • Gram-negative Organismen wird rot oder pink (vom counterstain).

          Abbildung 1. Gram-Färbung von N. meningitidis in CSF mit assoziierten PMN.

          N. meningitidis auftreten intrazellulär oder extrazellulär in PMN Leukozyten kann und wird als gramnegative, Kaffee-Bohne geformt Diplococcen erscheinen.

          Abbildung 2. Gram-Färbung von S. pneumoniae mit WBL

          S. pneumoniae kann intrazellulär auftreten oder extrazellulär und wird als grampositive, lanzettlich Diplococcen erscheinen, manchmal in kurzen Ketten auftreten.

          Abbildung 3. Gram-Färbung von H. influenzae

          H. influenzae pleomorphen gram-negative Stäbchen oder Bacillen mit zufälligen Anordnungen sind klein.

          Performing Latexagglutinations Tests

          Mehrere kommerzielle Kits sind für Latexagglutinations Tests zur Verfügung. Allgemeine Hinweise und Anweisungen für den Nachweis von löslichen bakteriellen Antigenen (Kapselpolysaccharid) sind unten angegeben, aber der Hersteller s Anweisungen im Kit enthalten sollte genau befolgt werden, wenn diese Tests. Für beste Ergebnisse sollte der Überstand der zentrifugierten CSF Probe so schnell wie möglich untersucht werden. Wenn eine sofortige Prüfung nicht möglich ist, können die CSF Probe im Kühlschrank gelagert werden (zwischen 2-8 C) für mehrere Stunden oder bei -20 eingefroren C für längere Zeiträume. Es ist zwingend notwendig, dass die Kits vor dem Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt werden, aber nie eingefroren, vor allem in tropischen Klimazonen wie die Kits bei hohen Temperaturen verschlechtern, die die Testergebnisse unzuverlässig vor dem Ablaufdatum des Kits machen kann.

          Latexagglutinations Verfahren für die CSF

          Folgen Sie dem Hersteller s Anweisungen auf der Packungsbeilage für den speziellen Latex-Kit verwendet wird. Allgemeine Hinweise sind nachfolgend aufgeführt:

          1. Zentrifugieren Sie die CSF für 10-15 Minuten bei 1000 x g und sammeln den Überstand.
            • Das Sediment sollte für Gram-Färbung und Primärkultur verwendet werden.
            • Erhitzen Sie das CSF Überstand werden für den Test bei 100 verwendet C für 3 Minuten.
            • Schütteln Sie die Latex-Reagenzien vorsichtig, bis sie homogen.
            • Geben Sie einen Tropfen jedes Latex-Reagenz auf einer Einwegkarte im Kit enthalten oder einem beringten Glasträger.
            • In 30-50 l des Überstands des CSF zu jedem Latexreagenzes.
            • Drehen von Hand für 2-10 Minuten. Falls vorhanden, wird die mechanische Drehung bei 100 Umdrehungen pro Minute empfohlen.
              • Zur Vermeidung von Kreuzkontamination beim Mischen und Abgeben von Reagenzien.
              • Untersuchen Sie die Agglutinationsreaktionen unter einem hellen Licht ohne Vergrößerung.
              Beim Lesen der Latex Agglutinationsergebnisse
              • Positive Reaktion: Agglutination (oder sichtbaren Verklumpung) der Latexpartikel und leichte Reinigung der Suspension erfolgt innerhalb von 2-10 Minuten (Abbildung 4).
              • Eine negative Reaktion bleibt die Suspension homogen und leicht milchig im Aussehen.

              Abbildung 4. Negative und positive Latexagglutinations Reaktionen

            • Schnelldiagnosetests (RDTs)
              1. RDT für Meningokokken-Meningitis

                RDTs wurden für die direkte Prüfung von CSF Proben ohne vorherige Wärme oder Zentrifugation (2) entwickelt. Der Test beruht auf dem Prinzip der vertikalen Strömungs Immunchromatographie, bei denen Goldpartikel und Nitrocellulosemembranen mit monoklonalen Antikörpern beschichtet sind lösliche Serogruppe spezifische Polysaccharid-Antigene in der CSF zu erfassen. Der Test besteht aus zwei Duplex-Papier-Sticks (auch genannt dipsticks), die zusammen Identifizierung von vier Serogruppen ermöglichen von N. meningitidis (A, C, W135 und Y). RDT1 Tests für die Serogruppen A und W135 / Y und RDT2 Tests für die Serogruppen C und Y.

                RDTs können in großen Mengen hergestellt werden, sind relativ preiswert und bleiben über Wochen stabil bei heißem Wetter, wenn vor Feuchtigkeit geschützt werden; daher sind sie praktisch zur sofortigen Prüfung von Proben bei widrigen Bedingungen. Erstbeurteilung RDTs auf gespeicherte CSF von Patienten in Niger mit zeigte eine korrekte Identifizierung der Meningokokken-Serogruppe 97% der Zeit (4). Jedoch neuere Studien unter Feldbedingungen haben ähnliche Spezifität gezeigt, aber viel geringere Empfindlichkeit von 70% (6) und im Gegensatz dazu ähnliche Empfindlichkeit aber viel geringere Spezifität (5).

                RDT Verfahren für die CSF

                Folgen Sie dem Hersteller s Anweisungen auf der Packungsbeilage. Allgemeine Hinweise sind nachfolgend aufgeführt:

                1. RDTs sollte bei 4 gespeichert werden C in einem feuchtigkeitsdichten Beutel bis zum Gebrauch.
                2. Legen Sie die beiden dipsticks (RDT1 und RDT2) in zwei getrennten Röhren (3 ml Einwegplastikröhrchen werden empfohlen) 150-200 l CSF oder einem Referenzstamm Suspension in PBS, pH-Wert 7,2.
                3. Nehmen Sie das chromatographische Ergebnis auf jedem Streifen nach 10-15 Minuten bei Raumtemperatur (25 C).
                4. Beim Lesen der RDT Ergebnisse
                  • Auftreten von roten Linien auf den dipsticks zeigt an, ob eine der vier Meningokokken-Serogruppen hat in der CSF (5) detektiert wurde.
                  • Die obere Linie auf dem Peilstab ist die positive Kontrolle und sollte immer vorhanden sein.
                  • Wenn der CSF bei einem der Serogruppen positiv ist, wird eine untere rote Linie ebenfalls vorhanden sein. Die Position dieser rote Linie zeigt den spezifischen Serogruppe auf der Basis der RDT, die getestet wurde. Siehe Abbildung 5 für die Ergebnis Kombinationen für jede Serogruppe.
                  • Ein negatives Ergebnis besteht aus einer einzigen oberen nur rosa Steuerleitung.

                  Abbildung 5. RDT Ergebnisse für N. meningitidis Serogruppen A, C, W135 und Y, sowie eine negative Kontrolle (2).

                  RDT für Pneumokokken-Meningitis

                  RDT kommerzielle Kits sind auch für S. pneumoniae Erkennung von Immunchromatographie. Das Prinzip ist das gleiche wie das oben beschriebene für N. meningitidis. Folgen Sie dem Hersteller s Anweisungen auf der Packungsbeilage.

                  Die Auswahl der primären Kulturmedien

                  Das beste Medium für das Wachstum von S. pneumoniae eine Blutagarplatte (BAP), die eine Trypticase-Soja-Agar (TSA) -Platte, enthaltend 5% Schafsblut ist. Menschliches Blut ist kein akzeptabler Ersatz für das Blut in den Agar, weil die im menschlichen Blut enthaltenen Antikörper können das Bakterienwachstum zu hemmen. S. pneumoniae wird auch auf einer Schokolade-Agar-Platte (CAP) wachsen.

                  Für H. influenzae. eine Kappe mit Wärme lysierten Blut hergestellt oder mit Hämin (X-Faktor) und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid ergänzt (NAD; V-Faktor) verwendet werden. Wachstum von H. influenzae auf ein BAP durch Zugabe einer Quelle von NAD erreicht werden kann, durchgeführt traditionell durch Quer Ausstreichen mit einem das Medium inokuliert Staphylococcus aureus oder Enterococcus Spezies Stamm. H. influenzae bildet Satellitenkolonien entlang der Länge des Staphylokokken oder Enterokokken-Wachstum. Zusätzlich Aufbringen Filterpapier (oder Scheiben), gesättigt mit Hämin und NAD zur Oberfläche des BAP, nachdem das Medium wurde ein Halo Wachstums um das Band oder Scheibe produzieren inokuliert.

                  N. meningitidis sowohl BAP und CAP wächst weiter. weil N. meningitidis wächst gut in einer feuchten Atmosphäre, wenn eine Infektion mit N. meningitidis vermutet wird, kann wählen laboratorians eine flache Pfanne von Wasser auf den Boden des Inkubators hinzuzufügen oder ein angefeuchtetes Papiertuch auf die Kerze Glas hinzufügen. Die Feuchtigkeitsquelle sollte regelmäßig Kontamination mit Schimmelpilzen zu verhindern geändert werden.

                  Normalerweise beide BAP und GAP für Subkultur verwendet. Wenn nur eine Art von Platte verfügbar ist, sollte eine GAP verwendet werden, weil sie die Hämin enthält und NAD benötigt für H. influenzae, während ein BAP nicht.

                  Wenn Primärkulturen kontaminiert sein scheinen, selektive Medien kann die Isolierung dieser Bakterien aus Proben verbessern, um eine Mischflora von Bakterien und / oder Pilzen. Für das primäre Isolierung von N. meningitidis. eine Schokolade-Agar-Basis Vancomycin, Colistin, Nystatin und Trimethoprim enthalten, können verwendet werden. Für die Isolierung von S. pneumoniae. CASO-Agar mit 5% Schafblut und entweder Gentamicin, Neomycin oder Sulfamethoxazol-Trimethoprim (SXT) kann nützlich sein. Für die Isolierung von H. influenzae. Schokolade-Agar mit Bacitracin verwendet werden. Andere Antibiotika-Formulierungen sind ebenfalls erhältlich.

                  QC der primären Kulturmedien

                  Alle primären Kulturmedien sollte für QC getestet werden, um sicherzustellen, dass die Medien die richtige Wachstum unterstützen N. meningitidis, S. pneumoniae. und H. influenzae. Eine Platte aus jeder neuen Charge von Medien erhalten, sollten Sie mit einem geeigneten, getestet werden gut charakterisierte Referenzstamm von N. meningitidis, S. pneumoniae. und / oder H. influenzae. Außerdem sollten alle Medien in regelmäßigen Abständen überprüft werden (alle 3 Monate), um sicherzustellen, dass es das Wachstum der entsprechenden Bakterien unterstützen können. Eine ungeimpften Platte aus jeder neuen Charge sollte auch, um für die Kontamination von Schimmel oder anderen Organismen im Labor und / oder Inkubator zu überprüfen, getestet werden. QC sollte auf Platten aus einer Menge wiederholt werden, wenn sie Temperaturen ausgesetzt wurden über 4 C, oder wenn es Grund zu der Annahme, dass die Platten, da die anfängliche QC durchgeführt wurde kontaminiert wurden.

                  Verfahren für die QC der primären Kulturmedien
                  1. Überprüfen Sie die Medien auf sichtbare mikrobielle Kontamination, Verfärbung, Austrocknung, Verschlechterung oder andere physikalische Defekte, die mit der Nutzung stören können.
                  2. Impfen der Medien mit Rein Kolonien 18-24 Stunden Wachstum eines gut charakterisierten Referenzstamm. Streak zur Isolierung und Inkubation für 18-24 Stunden bei 35-37 C mit

                  5% CO2 (Oder in einem Candle-Glas).

                5. Inkubieren einer ungeimpften Platte für 18-24 Stunden bei 35-37 C mit
                  5% CO2 (Oder in einem Candle-Glas).
                6. Untersuchen Sie die impft und ungeimpften Platten nach 18 bis 24 Stunden.
                7. Lesen QC Testergebnisse
                  • Passing Ergebnis: gesundes Wachstum des Referenzstamm auf geeigneten Medien und kein Wachstum auf ungeimpften Medien.
                  • Andernfalls Ergebnis: kein Wachstum oder schlechtes Wachstum des Referenzstamm auf geeigneten Medien und das Wachstum von Organismen auf der ungeimpften Medien.
                8. Inokulation von Primärkulturmedien von Liquorproben
                  1. Primärkultur direkt von CSF
                    1. Wenn der CSF kann sofort zu einem mikrobiologischen Labor transportiert werden (innerhalb von 1 Stunde ab dem Zeitpunkt der Sammlung) für Kultur und Analyse, impfen 1-5 Tropfen CSF (je nach Volumen im Labor erhalten haben) sowohl direkt auf eine BAP und CAP innerhalb 1 Stunden nach der Entnahme.
                      • Wenn der CSF zentrifugiert wurde, verwenden Sie 1 Tropfen der gut gemischten Sediment für Primärkultur.
                      • Eine sterile bakteriologischen Schleife, Kreuz Streifen des Inokulums mit einzelnen, isolierten Kolonien zu erhalten.
                        • Einweg-Schleifen werden bevorzugt, aber wenn eine Drahtschleife verwendet wird, muss es auf jedem Schritt des platten Ausstreichen Verfahren vor sterilisiert werden.
                        • BAP und CAP, die ordnungsgemäß ausgestrichen sind in den Figuren wurden 6. 7. und 8 gezeigt.
                        • Ein Back-up-Brühe (z Hirn-Herz-Infusionsbrühe mit der richtigen Ergänzungen) sollten mit einigen der Sediment Pellet beimpft werden.
                        • Agar-Platten und Brühe mit dem Liquor geimpft sollte für 18-24 Stunden bei 35-37 inkubiert werden C mit

                          Abbildung 6. Die richtige Streifen- und das Wachstum von N. meningitidis auf einer BAP

                          Abbildung 7. Die richtige Streifen- und das Wachstum von S. pneumoniae auf einer BAP

                          Abbildung 8. Die richtige Streifen- und das Wachstum von H. influenzae an einer CAP

                        • Primärkultur von Trans-Isolat (T-I) Medium
                          1. Wenn der CSF nicht sofort zu einem mikrobiologischen Labor transportiert werden können (innerhalb von 1 Stunde ab dem Zeitpunkt der Sammlung) für Kultur und Analyse, eine Flasche T-I-Medium sollte (1) geimpft werden. Um dies zu tun, die Aluminiumkappe mit einer Pinzette entfernen, wischen Sie den Gummistopfen mit 70% Alkoholtupfer (nicht verwenden PVP-Jod) und eine Spritze verwenden, um aseptisch impfen 0,5-1,0 ml des CSF in das TI-Medium für den Transport und das Wachstum von Bakterien.
                            1. Wenn das T-I-Medium kann nicht in einem mikrobiologischen Labor noch am selben Tag der Inokulation transportiert werden, legen Sie eine Entlüftungsnadel (sterilen Wattegestopft Injektionsnadel) durch den Gummistopfen der T-I-Flasche, die das Wachstum und das Überleben der Bakterien fördert.
                              • Achten Sie darauf, dass die Belüftungsnadel nicht die Brühe nicht berührt.
                              • Inkubieren Sie die geimpft T-I-Medium bei 35-37 C mit
                                5% CO2 (Oder in einem Kerzenglas) über Nacht oder bis zum Transport möglich ist. Wenn Transport verzögert mehr die 4 Tage, entfernen Sie den gelochten T-I-Flasche aus dem Inkubator oder Kerzenglas und legen Sie es bei Raumtemperatur (25 C) bis zum Versand.
                              • Entfernen Sie die Belüftungsnadel und wischen Sie den Gummistopfen mit 70% Alkohol vor dem Versand. Es ist wichtig, eine Kontamination zu vermeiden, wenn die Flaschen Probenahme Proben aseptisch zu erhalten.
                              • Sobald das T-I-Medium in der mikrobiologischen Labor ankommt, kann es sofort kultiviert werden.
                              • Wenn der T-I-Medium kann einem mikrobiologischen Labor, die am gleichen Tag der Inokulation transportiert werden, nicht entlüften nicht die T-I-Flasche, bis sie in der Empfangs Labor ankommt. Bei der Ankunft, wischen den Gummistopfen mit 70% Alkohol, legen Sie eine Belüftungsnadel in die T-I-Flasche, Inkubation bei 35-37 C mit
                                5% CO2 (Oder in einem Candle-Glas), und beobachten Sie täglich für die Trübung in der flüssigen Phase für bis zu 7 Tage.

                                • Vor der Subkultur, entfernen Sie die Belüftungsnadel und wischen Sie den Gummistopfen mit 70% Alkohol.
                                • Nicht Povidon-Iod auf dem Gummistopfen verwenden, da es kann somit durch die vorbeiziehende Nadel in das Medium durchgeführt werden, um das Wachstum von Bakterien hemmen.
                                • Nach 18-24 Stunden Inkubation bei 35-37 C mit
                                  5% CO2 (Oder in einem Candle-Glas) mit einer Entlüftungsnadel, eine sterile Nadel und Spritze 50-100 zu übertragen l des flüssigen Teils des T-I-Medium auf sowohl einer BAP und CAP für Primärkultur.

                                  • ungefähr 50-100 l wird auf Streifen jede Platte verwendet. Um Streifen zwei Platten, ziehen etwa 100-200 l mit der Spritze auf einmal die Möglichkeit einer Kontaminierung des T-I-Medium zu minimieren.
                                  • Streak die BAP und CAP für die Isolierung, Inkubation der Platten bei 35-37 C mit
                                    5% CO2 (Oder in einem Candle-Glas), und prüfen Sie die Platten täglich für bis zu 72 Stunden.
                                  • Wenn kein Wachstum beobachtet wird, Subkultur, die T-I-Medium wieder an Tag 4 und Tag 7.
                                  • Isolaten sollte immer für Reinheit des Wachstums untersucht werden, indem man auf Koloniemorphologie suchen, bevor eine Prüfung durchgeführt wird. Wenn eine Verunreinigung gesehen wird, sollte Kulturen werden erneut ausgestrichen Reinheit, um sicherzustellen, vor der Prüfung.
                                  • Wenn das T-I Medium kontaminiert zu sein scheint, selektive Medien verwendet werden können (siehe Abschnitt II.A).
                                  • Die Verarbeitung von Blutproben

                                    Das Laborpersonal Blutkultur Umgang mit den Proben müssen in der Lage sein, Bakterien auf geeigneten primären Kulturmedien zu isolieren und richtig isoliert Subkultur Reinkulturen zum Testen zu erhalten.

                                    Primärkultur aus einer Blutkulturflasche

                                    Die Blutkulturflasche sollte sofort geimpft werden (innerhalb von 1 Minute) nach der Blutabnahme aus dem Blut zu verhindern, in der Spritze Blutgerinnung. Die beimpften Blutkulturflasche sollte für die Inkubation und Subkultur so schnell wie möglich zu einem mikrobiologischen Labor transportiert werden.

                                    1. Wenn Transport zu einem mikrobiologischen Labor nicht möglich am selben Tag ist, legen Sie die Blutkulturflasche in einem Inkubator bei 35-37 C mit
                                      5% CO2 (Oder in einem Kerzenglas) bis zum Transport möglich ist. Beimpften Blutkulturflaschen nicht in den Kühlschrank gestellt werden.
                                    2. Wenn Transport zu einem mikrobiologischen Labor durchführbar ist am selben Tag, brüten die Blutkulturflasche bei 35-37 C mit
                                      5% CO2 (Oder in einem Candle-Glas).
                                    3. Untersuchen Sie die Blutkulturflasche bei 14-17 Stunden für Trübung und dann jeden Tag für bis zu 7 Tage. Jede Trübung oder Lyse von Erythrozyten sein kann ein Hinweis auf Wachstum und Subkulturen auf Primärkulturmedien sollte unverzüglich erfolgen.
                                      • weil N. meningitidis, S. pneumoniae. und H. influenzae sind zerbrechlich Organismen sollten Subkulturen am Tag 4 und Tag 7 unabhängig von Trübung durchgeführt werden, da das Fehlen der Trübung mit der Abwesenheit von Bakterienwachstum nicht immer korreliert.
                                      • Vor Subkultur, schwenken die Blutkulturflasche mehrmals den Inhalt zu mischen.
                                      • Desinfizieren Sie die Gummimembran der Blutkulturflasche mit 70% Alkoholtupfer.
                                        • Nicht Povidon-Iod auf dem Gummiseptum verwenden, da es kann somit durch die vorbeiziehende Nadel in das Medium durchgeführt werden, um das Wachstum von Bakterien hemmen.
                                        • Alternativ, wenn die Blutkulturflasche einen Schraubverschluss hat, die Flasche öffnen und die Flüssigkeit unter Verwendung einer sterilen Technik entfernen (das heißt die Flaschenmündung beim Öffnen flammend und Schließen der Kappe).
                                        • Absaugen 1 ml mit einer sterilen Spritze und Nadel aus der Kulturflasche Blut und übertragen 0,5 ml einer BAP und 0,5 ml zu einem CAP.
                                        • Streak die Platten für die Isolierung, Inkubation bei 35-37 C mit
                                          5% CO2 (Oder in einem Candle-Glas), und täglich bis zu 72 Stunden.
                                        • Isolaten sollte immer für Reinheit des Wachstums untersucht werden, indem man auf Koloniemorphologie suchen, bevor eine Prüfung durchgeführt wird. Wenn eine Verunreinigung gesehen wird, sollte Kulturen werden erneut ausgestrichen Reinheit, um sicherzustellen, vor der Prüfung.
                                        • Sobald reine Bakterienwachstum wurde durch Subkultur aus dem Blutkulturflasche bestätigt worden ist, sollte die Flasche gemäß angemessenen Sicherheitsverfahren entsorgt werden.
                                        • MacConkey Agar-Medien

                                          Wenn das Labor für Mikrobiologie über die Ressourcen für Subkultur die Verwendung einer dritten Platte zu unterstützen, sollten MacConkey Agar verwendet werden, insbesondere, wenn die Probe von einem Patienten mit Fieber unbekannter Herkunft wurde erhalten, wenn Typhus (S. typhi ) Ist symptomatisch, oder wenn eine Gram-Färbung von Blutkulturbrühe zeigt gram-negative Bakterien vermutet. MacConkey-Agar wurde entwickelt gram-negative Bakterien wachsen und sie für Lactosefermentation beflecken, um diejenigen zu unterscheiden, die den Zucker Lactose (Lac +), von denen fermentieren können, die nicht (Lac-). Es enthält Gallensalze (die meisten gram-positive Bakterien zu inhibieren, mit der Ausnahme Enterococcus und einige Arten von Staphylococcus. d Staphylococcus aureus ), Kristallviolett-Farbstoff (die auch bestimmte gram-positive Bakterien), neutral red dye, (die Flecken Mikroben fermentierenden Milchzucker), Lactose und Pepton hemmt.

                                          1. Übertragen etwa 0,5 ml der Blutkulturbrühe auf MacConkey-Agar und Streifen für isolierte Kolonien.
                                          2. Inkubieren Sie die MacConkey Agar für 18-24 Stunden bei 35-37 C mit
                                            5% CO2 (Oder in einem Candle-Glas).
                                          3. Überprüfen Sie Platte für Wachstum und identifizieren die Bakterien (Abbildung 9).
                                          4. Abbildung 9. Wachstum von Salmonellen ser. Typhi auf MacConkey-Agar

                                            Makroskopische Untersuchung der Kolonien

                                            Präsumtiven Identifizierung von N. meningitidis. S. pneumoniae, und H. influenzae kann auf einer BAP und CAP und Gram-Färbung der Organismen (Tabelle 1 und die Figuren 10 und 11) auf der Basis von Wachstum und Koloniemorphologie hergestellt werden.

                                            Tabelle 1. präsumtiven Identifizierung von N. meningitidis. S. pneumoniae. und H. influenzae basierend auf Wachstum auf primären Kulturmedien und Gram-Färbung Ergebnisse

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